ETAPA 1/2018
Rezumat etapa
În cadrul etapei 1/2018 a fost obtinut avizul favorabil pentru implementarea studiului. Fiecare pacient inclus in studiu are un cod unic, regasit si pe setul de fise. Codul permite identificarea in biobanca a datelor clinice, histopatologice si a materialelor biologice dar nu face legatura cu datele personale de identificare ale acestuia respectand astfel normele etice nationate si internationale. Au fost stabilite atat protocoalele de examinare şi câmpurile bazei de date, cat si fluxul de lucru pentru implementarea şi execuția activităților din cadrul subproiectelor 1 şi 2. De asemenea, au fost optimizate protocoalelor necesare pentru desfășurarea în condiții optime a activităților proiectului precum:
- protocolul de izolare celule tumorale din peritoneu/ascită
- izolare ARN total din probe de tesut inghetat
- izolare ARN din probe sange/ probe tisulare/ ascită
- metodologia de analiză a miRNA
- metodologia de validare a speciilor de microARN prin Real-Time PCR
- metode de studiu citotoxicitate pe liniile celulare de cancer de ovar A2780 si SKOV-3
ETAPA 2/2019
Rezumat etapa
In cadrul etapei 2/2019 au fost incluse 19 paciente cu cancer de san si 54 paciente cu adenocarcinom ovarian seros. Probele de la pacientele cu tumora primara de san si ovar au fost bancate, respectiv sange tesut tumoral, tesut non-tumoral, tesut metastatic si ascita. Celulele epiteliale tumorale din ascita formata in carcinomul ovarian seros dar si din nodulii peritoneali (carcinomatoza peritoneala, CP) joaca un rol esential in recurenta bolii si in rezistenta la medicamente, prin urmare, stabilirea culturilor primare de celule derivate din ascita ne va permite sa dezvoltam strategii terapeutice noi in managementul pacientelor cu cancer ovarian seros recurent. Au fost generate culturi primare pentru 14 probe de ascita si 10 noduli peritoneali. S-a realizat izolarea ADN genomic si ARN total pentru studiile ulterioare. Profilul miRNA de diagnostic care va fi validat în acest studiu va fi generat în urma analizei miRNA pe un panel de miRNA asociate cu cancerul ovarian ca ținte potențiale de diagnostic și indicatori prognostici.
Au fost initiate experimentele de citotoxicitate pe liniile celulare A2780 si SKOV3. Tratamentele care utilizează agenți specifici care vizează numai o cale, eșuează de obicei în tratamentul cancerului. Tratamentele combinate care utilizează agenți chimioterapeutici cu mecanisme moleculare distincte sunt considerate mai promițătoare pentru o eficacitate mai mare. Astfel, in perioada de raportare au fost optimizate si validate dozele optime in tratamente individuale pentru 3 medicamente, respectiv paclitaxel, cisplatin si doxorubicina urmand ca in etapa viitoare sa fie testate combinatii intre cele 3 chimioterapeutice cu și fără inhibitor PARP (AZD2461). De asemenea au fost realizate si teste de validare pentru terapia optima selectata și pe probele bancate de la pacientele cu cancer ovarian avansat care prezinta mutație BRCA1/2 și care au primit terapie de întreținere cu inhibitor PARP în prima linie.
ETAPA 3/2020
Rezumat etapa
In cadrul etapei 3/2020 au fost incluse 3 paciente cu cancer de san si 8 paciente cu adenocarcinom ovarian seros. Probele de la pacientele cu tumora primara de san si ovar au fost bancate, respectiv sange tesut tumoral, tesut non-tumoral, tesut metastatic si ascita. Au fost generate culturi primare pentru cele 8 probe de ascita si noduli peritoneali. Totalul probelor bancate de ICF este de 83 (total proiect 1 si 2). S-a realizat izolarea ADN genomic si ARN total pentru studiile ulterioare. 8 paciente de la care a fost izolat ARN total au fost incluse in lotul de descoperire. Acestea au fost analizate din punct de vedere al expresiei unui panel de gene implicate in EMT: Citokeratina 18 (CK18), Citokeratina 19 (CK19), Vimentina, N-Caderina, E-Caderina și EpCAM si din punct de vedere al expresiei proteice a acelorasi markeri, prin tehnica de imunohistochimie. Caracterizarea imunohistochimica a culturilor primare derivate din lichidul de ascita si nodulii peritoneali s-a realizat pentru markerii specifici epiteliali E-Caderina si CK7, pentru markerul mezenchimal Vimentina, si pentru markerii metabolici CK 8-18/CK19 si PDL 1 –marker imunogenic. In plus, experimentele de evaluare a unui set de molecule de microARN initiate in etapa 2/2019 au continuat cu analiza speciilor de microARN prin tehnologia microarray (Agilent) pentru identificarea profilurilor de expresie pentru ascita (AS cultura primara) și nodul peritoneal (NP cultura primară). Compararea profilurilor de expresie s-a realizat prin raportarea la nodulul peritoneal tesut, si respectiv tesutul tumoral si normal. Au fost analizate prin tehnologia microarray (Agilent) 24 de probe, respectiv cele 6 paciente din lotul de descoperire confirmate cu carcinom ovarian. Experimentul de Microarray a fost realizat folosind kitul miRNA Microarray System cu miRNA Complete Labeling and Hyb de la Agilent Technologies. Etapele de lucru au fost descrise anterior si au inclus: (1) legarea fluorescentă a miRNA (2) hibridizarea la ADN (3) spălarea şi scanarea lamei (4) procesarea datelor cu ajutorul softului Agilent 12.0.3.1 (conține 3000 de specii umane de miRNA). Analiza bioinformatică a semnăturilor de expresie ale speciilor de microARN a evidențiat un top 10 al miRNA modificate semnificativ statistic (supra sau sub-exprimate) între culturile de celule primare izolate din (AS) si nodul peritoneal (NP) în comparație directă cu NP tesut si tesutul tumoral (T)/normal (N). Datele preliminare obtinute pentru cele 6 paciente incluse in lotul de descoperire au permis selectia unui panel de miRNA pentru validarea prin RT-PCR pe lotul de validare. Selectia a avut la baza expresia lor diferită în cultura primara (AS si NP) comparativ cu NP tesut sau cu tesutul tumoral (supra sau sub-exprimate) şi asigurându-ne de la început că avem un nivel de expresie suficient de ridicat dat de platforma de microarray Agilent. Profilul miRNA de diagnostic care va fi validat în acest studiu va fi generat în urma analizei miRNA pe un panel de miRNA asociate cu cancerul ovarian ca ținte potențiale de diagnostic și indicatori prognostici.
Experimentele pe liniile celulara A2780 si SKOV3 au continuat si in etapa 3/2020 prin evaluarea funcțională a unor medicament precum: paclitaxel, doxorubicina, cisplatin si AZD2461 (PARP inhibitor, agent de nouă generatie dupa olaparib). Pentru a stabili concentrația fiecarui medicament la care răspunsul este redus la jumătate s-a determinat viabilitatea si a fost calculat IC50 prin tehnica MTT. Suplimentar, a fost evaluata rata de migrare a celulelor SKOV3, ca raspuns la dozele de cisplatin si doxorubicina selectate. Gradul de vindecare a marcajului creat ofera informații atat despre caracteristicile migrației, viabilitatea celulelor și capacitatea de a interacționa cu alte celule, cat si date suplimentare despre modul în care moleculele testate pot afecta fiecare dintre acești parametri. La finalul experimentului celulele au fost colectate pentru izolare de ARN si proteine. ARN este utilizat pentru analiza modificarilor dezvoltate pe baza fenomenului de EMT, ca rezultat al tratamentului cu dozele de medicamente selectate (ca agenti unici si in combinatie cu AZD2461) si proteinele vor fi analizate prin tehnica multiplex Luminex. Migrația celulară este o parte integrantă a proceselor biologice de bază, cum ar fi formarea țesuturilor, procesul de reparare și răspunsul imun, precum și procesele de invazie tumorala și metastazarea. Cunoașterea avansată și înțelegerea mecanismului migrației colective a celulelor este crucială pentru a dezvolta noi strategii terapeutice.