» NEXTgenED

NEXTgenED

Rezultate Publicatii Contact

Obiective generale

Ȋn proiectul NEXTGenED vom investiga cauzele genetice şi epigenetice implicate în progresul carcinomului hepatocelular (HCC). Vom utiliza cele mai noi tehnologi de editare a genomului pentru a studia mecanismul inițierii și dezvoltării HCC. S-a demonstrat că hipermetilarea promotorului genelor joacă un rol crucial în dezvoltarea cancerului hepatic. Astfel, ne propunem să studiem starea de metilare a promotorilor implicați în silentiere epigenetică. Mai exact, vom studia demetilarea promotorilor hipermetilați implicați în HCC prin utilizarea celor mai noi tehnologii Casilio (sistem CRISPR/Cas9) și de editare primară a genomului pentru a realiza demetilarea promotorului genei și a restabili expresia genei împreună cu proteina corespunzătoare. De asemenea, vom investiga rolul mutațiilor în dezvoltarea cancerului hepatic. Intenționăm să utilizam tehnologii de editare de baze și editare primară pentru a corecta mutațiile și a restabili aminoacizii alelei normale. Ne propunem să facem această investigație genetică utilizând atât culturi de celule primare, cât și culturi de organoizi pentru a realiza un studiu cuprinzător care ne va conduce la o mai bună înțelegere a inițierii și dezvoltării HCC. De asemenea, vom realiza un studiu comparativ între organoizii nontumorali, organoizii tumorali şi organoizii tumorali cu mutația corectată împreună cu screening-ul medicamentelor.

Implementarea proiectului va elucida rolurile defectelor genetice și epigenetice care au apărut în timpul inițierii și dezvoltării HCC şi va dezvolta noi strategii terapeutice.

Obiective specifice

OS 1: Reactivarea genelor hipermetilate patologic care sunt implicate în dezvoltarea cancerelor hepatice în modelele organoide prin editarea genomului cu ajutorul CRISPR/Cas9

OS 2: Corectarea mutațiilor patogene indel (inserție și deleție) prin editare primară

OS 3: Reintroducerea aminoacidului din alele normală în genă mutantă folosind tehnologii de editare primară și de editare a bazelor

OS 4: Studiu comparativ pentru translatarea clinică a organoizilor derivaţi de la pacienți tratați cu medicamente (cu mutații necorectate și corectate) și screeningul medicamentelor pentru a identifica sensibilitatea la agenții terapeutici ai organoizilor

Generarea de organoizi cancerigeni din tesutul primar al pacientului permite testarea unei game de agenți terapeutici cu aplicatii in medicina personalizata.

Toate aceste obiective ne vor permite să obținem o perspectivă mecanistică asupra proceselor de inițiere și evoluție a HCC în organoizi, ceea ce poate duce la un tratament personalizat al pacienților cu HCC.

ETAPA DE RAPORTARE: ETAPA 1/2024 (01.04.2024 – 30.06.2024)

Rezumat etapa 1/2024: A fost obtinut avizul favorabil pentru implementarea studiului cu nr. 32744/08.07.2024, aviz eliberat de catre Comisia de Etica a Institutului Clinic Fundeni. Includerea în proiectul NEXTGenED a pacientilor se va face cu respectarea normelor etice naționale si internationale în vigoare conform formularului de consimtamant liber exprimat. Procedura de receptionare si prelucrare a probelor (Biobancarea) va include proceduri specifice pentru bancare probe sange, tesut tumoral si non-tumoral. Pentru toate probele receptionate în vederea înregistrarii şi biobancării a fost stabilita fisa de receptionare a probelor biologice (fisa de includere in studiu). In perioada de raportare au fost dezvoltate protocoalele şi procedurile de lucru, astfel au fost intocmite protocoalele de lucru pentru 1) izolarea celulelor din ficat 2) disocierea celulelor din ficat si 3) Însămânțarea celulelor în matrigel pentru obtinerea organoizilor 4) pasarea organoizilor si 5) diferentierea hepatocitelor in vitro. De asemenea, a fost iniţiată dezvoltarea protocoalelor şi a procedurilor de lucru pentru activitatile din etapa 2: construcţia sgRNA pentru demetilarea promotorului CDKN2A si respectiv producerea si purificarea adenovirusurilor asociate si lentivirusurilor. A fost realizat: 1) Design-ul primerilor 2) Lista de primeri necesară pentru clonarea sgRNA-urilor 3) protocol optimizat pentru producerea si purificarea adonovirusurilor asociate

ETAPA DE RAPORTARE: ETAPA 2/2024 (01.07.2024 – 31.12.2025)

Rezumat etapa 2/2024: Pe parcursul etapei 2 a fost iniţiată activitatea de includere in studiu a pacienţilor, respectiv de izolare celule hepatice, fiind realizată bancarea de probe pentru 19 pacienţi în timp ce banca de celule primare master (P0-P4) a fost realizată pentru 9 donatori in vederea realizării experimentelor propuse. Totodata s-a realizat amplificarea plasmidelor necesare pentru demetilarea promotorului CDKN2A. Pentru acest scop s-au preparat celule DH5α competente si s-au trasnformat cu constuctele necesare pentru demetilare, iar apoi s-a izolat ADN-ul plasmidial. S-a initiat procesul de clonare a sgRNA specifici pentru promotorul CDKN2A. Inainte de a se clona efectiv sgRNA este necesar sa se construiasca 2 vectori: unul fiind reprezentat de vectorul de clonare, iar celalalt vector care va servi drept template pentru generarea celor 8 sgRNA-uri. Astfel pentru constructia celor 2 vectori s-a amplificat vectorul si doua fragmente urmat de asamblarea Gibson. În vederea determinari statusului de metilare a promotorului CDKN2A, s-a izolat ADN-ul genomic din liniile celurare HepG2 si Huh7 cu ajutoului unui kit, urmat de tratarea cu bisulfit pentru conversia citozinei nemetilate in uracil si astfel putandu-se determina statusul metilarii promotorului. De asemenea, s-a izolat ARN-ul totat din linile celulare HepG2, Huh7 si Hep3B in vederea clonarii genelor TP53, CTNNB1, LRP1B, ARID1A, AXIN1, ARID2 si determinarii prezentei de mutatii punctiforme si mutatii de tip indel. In acest context, s-au amplificat si izolat plasmidele necesare pentru corectia mutatiilor punctiforme si de tip indel, iar apoi identitatea plasmidelor izolate s-a verificat prin digestia cu enzime de restrictie cu specificitate de clivare unica in secventa plasmidiala.

ETAPA DE RAPORTARE: ETAPA 3/2025 (01.01.2025 – 30.06.2025)

Rezumat etapa 3/2025: În etapa 3 a continuat activitatea de includere a pacienților în studiu, respectiv izolarea celulelor primare hepatice, fiind efectuată stocarea probelor pentru 17 pacienți, în timp ce biobanca de organoizi hepatici derivaţi de la pacienti (PDO) (P0-P4) a fost creată pentru 6 probe de ţesut hepatic non-tumoral și 4 probe de tesut hepatic tumoral în vederea desfășurării experimentelor propuse. Pacienții au fost clasificați în funcție de afecțiunile lor după cum urmează: 9 pacienți cu carcinom hepatocelular (HCC), 2 pacienți cu adenocarcinom metastatic (ADK), 1 pacient cu colangiocarcinom tumoral (CCA) și 5 pacienți aflați în faza de diagnostic patologic. Grupul este reprezentat de 65% bărbați și 35% femei, cu o vârstă medie de 65 de ani. Totodată, au fost identificate două tipuri distincte de celule pe baza fenotipurilor lor, definite ca epiteliale și respectiv mezenchimale. În acest scop, nivelurile de expresie ale markerilor albumină (ALB), citokeratină-18 (KRT-18), citokeratină-19 (KRT-19), Nanog, SOX2 și vimentină (VIM) au fost evaluate în culturi de celule tumorale primare, comparativ cu țesutul tumoral original corespunzător, utilizând tehnologia qRT-PCR. Rezultatele au confirmat stabilirea a două tipuri distincte de culturi celulare primare, caracterizate printr-o morfologie epitelială susținută de prezența markerilor ALB și KRT-18 și o morfologie mezenchimală indicată de expresia markerilor KRT-19 și VIM. Toate specimenele biologice colectate și procesate de la cei 17 pacienți au fost incluse în baza de date a biobancii proiectului NEXTgenED, inclusiv organoizii derivați de la pacienți (PDO). Pentru a determina strategia de demetilare a promotorului, a fost adoptat sistemul de demetilare țintit Casilio-ME bazat pe CRISPR-Cas9. Pentru producerea și purificarea virusului adenoasociat, a fost utilizat un protocol de co-transfecție a celulelor HEK293T17 cu 3 plasmide: pAAV2/8 (codifică capsida AAV8), pAdDeltaF6 (codifică gene helper esențiale pentru producerea de AAV, de origine adenovirală), pAAV-GFP (codifică genele sistemului CRISR/Cas9). Eficiența transducției AAV care conține genele pentru editarea de bază sau editarea primară va fi evaluată utilizând un anticorp anti-dCas9 si prin vizualizarea fluorescentei produsa de expresia GFP-ului.

În final, a fost creată o bază de date integrată de probe de ADN și ARN extrase din țesuturi tumorale și non-tumorale atât pentru cohorta prospectivă NEXTgenED, cât și pentru cohorta retrospectivă propusă în etapa 2, respective 53 de pacienți (35 HCC și 18 CCA), permițând investigarea expresiei genelor specifice tumorilor hepatice și facilitând identificarea de noi biomarkeri pentru diagnostic și potențiale ținte terapeutice, în corelație cu datele clinicopatologice și moleculare ale pacienților.

ETAPA DE RAPORTARE: ETAPA 4/2025 (01.07.2025 – 31.12.2025)

Rezumat etapa 4/2025: În această etapă, au fost incluși în studiu un număr de 11 pacienți, diagnosticați cu carcinom hepatocelular (HCC) și tumori hepatice mixte (HCC + colangiocarcinom). În plus, au fost generate probe de culturi primare 2D și organoizi, provenite din țesutul tumoral și non-tumoral. În perioada de raportare, au fost incluse în biobancă: culturi primare 2D non-tumorale (n=5) și tumorale (n=5); organoizi tumorali (n=7) și non-tumorali (n=8). De asemenea, a fost optimizat protocolul de imunohistochimie a culturilor 3D, care a condus la caracterizarea acestora. În cadrul OB1: Reactivarea genelor hipermetilate patologic care sunt implicate în dezvoltarea cancerelor hepatice în modelele organoide prin editarea genomului cu ajutorul CRISPR/Cas9, a fost identificat un pacient diagnosticat cu HCC, care prezintă hipermetilarea promotorului genei CDKN2A. Datele au fost confirmate cu ajutorul liniilor celulare imortalizate Huh7-D12 (cu promoter hipermetilat) comparativ cu HepG2 (control). Astfel, pentru finalizarea acestui obiectiv, au fost generați cinci vectori plasmidiali multiplex, care conțin 2/3/4/5/6 molecule guide RNAs. În vederea îndeplinirii OB2 și OB3, au fost interpretate datele de secvențiere a întregului genom (WGS) pentru trei pacienți cu HCC (incluși în cadrul proiectului), în probe de țesut tumoral și non-tumoral adiacent, pentru a profila complet mutațiile somatice. Analiza datelor de secvențiere a identificat două mutații punctiforme cunoscute la un pacient cu HCC, ambele localizate într-o regiune hotspot. Utilizând prime editing bazată pe sistemul CRISPR/Cas9, celulele și organoizii derivați de la pacient vor fi folosiți pentru corectarea acestor mutații și pentru restabilirea secvenței de aminoacizi corespunzatoare alelei normale. Totodată, pentru a evalua nivelul de expresie al genelor cu mutații identificate, a fost realizată secvențierea întregului transcriptom la acești pacienți, iar datele au fost validate prin analiza real-time qPCR.

Articole ISI publicate:

Immunomodulatory Functions of TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand in Type 1 diabetes – Fogarasi M, Dima S. Diabetes (Review), Cells 2024, 13(20), 1676; 2024 https://doi.org/10.3390/cells13201676
PARP inhibitor augments anti-tumor efficacy of DNMT inhibitor by inducing senescence in cholangiocarcinoma- Peili Wang, Rong Xiao, Jianfeng Chen, Peiyong Guan, Hong Lee Heng, Lizhen Liu, Yali Wang, Xian Zeng, Guixiang Zhong, Jing Hao, Jiuping Gao, Jason Yongsheng Chan, Simona Dima, Choon Kiat Ong, Bin Tean Teh, Mei Li, Jing Han Hong, Jing Tan. Int J Biol Sci.;21(8):3649-3665, PMID: 40520005, PMCID: PMC12160928, DOI: 10.7150/ijbs.110947
Development of vectors for reformatting scFv fragments derived from phage display libraries into native IgG1 structures for in vivo imaging and therapeutic applications – Marton Fogarasi, Corina Roman, Simona Dima. Journal of Immunological Methods, volume 542, 113899, 2025 https://doi.org/10.1016/j.jim.2025.113899

Comunicări la congrese naționale/ internaționale

Croitoru M-G, Ionescu V, Șorop A, Ghionescu A-V, Toma R, Vâlcu C, Lixandru D, Fogarasi M, Cucu D, Herlea V, Dima S-O, Ong C-K. Metode de caracterizare a organoizilor hepatici și noi perspective pentru investigații genomice avansate. Zilele Științifice ale Institutului Clinic Fundeni. 10-12 decembrie 2025. București, România (prezentare orală).
Ionescu V, Croitoru M-G, Șorop A, Ghionescu A-V, Toma R, Vâlcu C, Lixandru D, Fogarasi M, Gheorghiu M, Herlea V, Dima S-O, Ong C-K. Eterogeneitatea micromediului tumoral – factor determinant în optimizarea culturilor de organoizi hepatici pentru cercetare genomică. Zilele Științifice ale Institutului Clinic Fundeni. 10-12 decembrie 2025. București, România (prezentare orală).
Proiectul a fost promovat la International Medical Students’ Congress of Bucharest (IMSCB, https://imscbucharest.com/), un eveniment științific organizat de Universitatea de Medicină și Farmacie „Carol Davila”, desfășurat în perioada 3-7 decembrie 2025. Pentru a sprijini diseminarea, a fost pregătit și expus la congres un poster științific care a prezintat contextul, obiectivele și principalele rezultate ale proiectului. Mai mult, pe parcursul evenimentului, membrii echipei de proiect au purtat discuții științifice cu studenții și membrii facultății pe tema proiectului. Dima S-O, Fogarasi M, Lixandru D, Șorop A, Ghionescu A-V, Croitoru M-G, Ionescu V-Ș, Roman C, Toma R-M, Petre-Lixandru I-O. In vitro models for the study of liver function assessment or therapeutic opportunities in liver cancer. International Medical Students’ Congress of Bucharest. 3-7 decembrie 2025. București, România (poster).

CONTACT: INSTITUTUL CLINIC FUNDENI

Adresa: Sos. Fundeni nr. 258, sector 2, Bucuresti

Telefon: 0213172194

Fax: 021.318.04.44

E-mail: [email protected]

Director de proiect: ONG CHOON KIAT