ETAPA DE RAPORTARE: etapa nr.1/2022
Denumirea etapei 1: Obtinerea culturilor primare de hepatocite (1-2 culturi) (partial). Analiza rolului miRNA specifice in procesul de transdiferentiere a ficatului la pancreas (partial) Optimizare protocoale de lucru studiu animal – in vivo (partial)
Rezumat etapa 1: Pe parcursul primei etape a fost initiata si optimizata izolarea de celule hepatice (2 donatori) in vederea realizarii bancii de celule master (P0-P4). Au fost stabilite analizele de expresie genica si proteica pentru un panel reprezentativ de biomarkeri (vimentina, N si E-Caderina, CK-18, Snail) de inclus pentru cele doua tipuri de celule, de tip hepatocitar si cele transdiferenţiate, de tip β pancreatice. Experimentele de manipulare a expresiei miRNA vor fi realizate initial pentru miR-424-5p si miR-26a inaintea procesul de transdiferentiere si se vor desfasura conform unui design experimental ce implica inhibarea si supraexpresia in sistem de culturi bidimensionale, aderente, a stocurilor generate in cadrul miR-Diab de la pacienti diabetici, comparandu-se expresia acestora cu stocurile de la pacientii non-diabetici de referinta. In acelasi timp, am demarat pregatirea loturilor de animale pentru a analiza în continuare eficacitatea procesului de transdiferenţiere prin implantarea subcutanata (Sub-Q) la soarecii imunodeficienti SCID-Beige.
ETAPA DE RAPORTARE: etapa nr.2/2023
Denumirea etapei 2: Obtinere culturi primare de hepatocite (3-5 pacienti) Analiza rolului miRNA selectate in procesul de transdiferentiere a ficatului la pancreas Studiul animal in vivo – follow-up 3-4 luni (2 modele) (partial) Diseminare.
Rezumat etapa 2/2023: Pe parcursul etapei 2 a fost continuată activitatea de includere in studiu de pacienţi noi, respectiv de izolare celule hepatice, fiind realizată banca de celule master (P0-P4) pentru 4 donatori in vederea realizării experimentelor propuse. S-a realizat clonarea factorilor transcriptionali PDX1, NeuroD1, MAFA si FOXA2, miR-ul mimic si inhibitor (miR-424-3p si miR-424-5p) in vectorul de expresie pAdTrack-CMV. De asemenea, s-au construit adenovirusurile corespunzatoare pentru fiecare construct, prin impachetare si amplificare in celulele Ad-HEK-293. Folosind cromatografia, adenovirusurile amplificate au fost purificate si apoi titrate pentru a determina numarul particulelor virale infectioase pentru a fi folosite in etapa urmatoare la transdiferentierea celulelor hepatice in celule β-pancreatice secretoare de insulina. Experimentele de manipulare a expresiei miRNA au fost realizate initial pentru miR-424-5p si miR-26a folosind reactivul de transfecţie RNAiMax inaintea procesul de transdiferentiere cu 24, 48 si 96 de ore (n=3). In acelasi timp, a fost finalizat un studiu pentru stabilirea importantei factorului VEGF-A in vivo pe soarecii SCID-Beige (n=75) si am demarat pregatirea loturilor pentru cele 2 modele propuse pentru a analiza în continuare eficacitatea procesului de transdiferenţiere prin implantarea subcutanata (Sub-Q) a celulelor netransdiferentiate (NT), transdiferenţiate (TD), TD cu miR supraexprimat (TDmiR+), si TD cu miR inhibat (TDmiR-) impreuna cu celule care exprima VEGF-A (n=128).