ETAPA DE RAPORTARE: etapa nr.1/2022
Denumirea etapei 1: Obtinerea culturilor primare de hepatocite (1-2 culturi) (partial). Analiza rolului miRNA specifice in procesul de transdiferentiere a ficatului la pancreas (partial) Optimizare protocoale de lucru studiu animal – in vivo (partial)
Rezumat etapa 1: Pe parcursul primei etape a fost initiata si optimizata izolarea de celule hepatice (2 donatori) in vederea realizarii bancii de celule master (P0-P4). Au fost stabilite analizele de expresie genica si proteica pentru un panel reprezentativ de biomarkeri (vimentina, N si E-Caderina, CK-18, Snail) de inclus pentru cele doua tipuri de celule, de tip hepatocitar si cele transdiferenţiate, de tip β pancreatice. Experimentele de manipulare a expresiei miRNA vor fi realizate initial pentru miR-424-5p si miR-26a inaintea procesul de transdiferentiere si se vor desfasura conform unui design experimental ce implica inhibarea si supraexpresia in sistem de culturi bidimensionale, aderente, a stocurilor generate in cadrul miR-Diab de la pacienti diabetici, comparandu-se expresia acestora cu stocurile de la pacientii non-diabetici de referinta. In acelasi timp, am demarat pregatirea loturilor de animale pentru a analiza în continuare eficacitatea procesului de transdiferenţiere prin implantarea subcutanata (Sub-Q) la soarecii imunodeficienti SCID-Beige.
ETAPA DE RAPORTARE: etapa nr.2/2023
Denumirea etapei 2: Obtinere culturi primare de hepatocite (3-5 pacienti) Analiza rolului miRNA selectate in procesul de transdiferentiere a ficatului la pancreas Studiul animal in vivo – follow-up 3-4 luni (2 modele) (partial) Diseminare.
Rezumat etapa 2/2023: Pe parcursul etapei 2 a fost continuată activitatea de includere in studiu de pacienţi noi, respectiv de izolare celule hepatice, fiind realizată banca de celule master (P0-P4) pentru 4 donatori in vederea realizării experimentelor propuse. S-a realizat clonarea factorilor transcriptionali PDX1, NeuroD1, MAFA si FOXA2, miR-ul mimic si inhibitor (miR-424-3p si miR-424-5p) in vectorul de expresie pAdTrack-CMV. De asemenea, s-au construit adenovirusurile corespunzatoare pentru fiecare construct, prin impachetare si amplificare in celulele Ad-HEK-293. Folosind cromatografia, adenovirusurile amplificate au fost purificate si apoi titrate pentru a determina numarul particulelor virale infectioase pentru a fi folosite in etapa urmatoare la transdiferentierea celulelor hepatice in celule β-pancreatice secretoare de insulina. Experimentele de manipulare a expresiei miRNA au fost realizate initial pentru miR-424-5p si miR-26a folosind reactivul de transfecţie RNAiMax inaintea procesul de transdiferentiere cu 24, 48 si 96 de ore (n=3). In acelasi timp, a fost finalizat un studiu pentru stabilirea importantei factorului VEGF-A in vivo pe soarecii SCID-Beige (n=75) si am demarat pregatirea loturilor pentru cele 2 modele propuse pentru a analiza în continuare eficacitatea procesului de transdiferenţiere prin implantarea subcutanata (Sub-Q) a celulelor netransdiferentiate (NT), transdiferenţiate (TD), TD cu miR supraexprimat (TDmiR+), si TD cu miR inhibat (TDmiR-) impreuna cu celule care exprima VEGF-A (n=128).
ETAPA DE RAPORTARE: etapa nr.3/2024
Denumirea etapei 3: Studiul animal in vivo – follow-up 3-4 luni (2 modele) Diseminare
Rezumat etapa 3: Pe parcursul etapei 3 au fost finalizate experimentele de manipulare a expresiei miRNA pentru miR-424-5p si miR-26a, supraexprimare si inhibiţie (n=4). De asemenea, a fost continuată atât clonarea factorilor transcriptionali PDX1, NeuroD1, MAFA si FOXA2, cât şi miR mimic şi inhibitor (miR-424-3p si miR-424-5p) în vectorul de expresie pAdTrack-CMV. Factorii de transcriptie pancreatici clonaţi au fost utilizati pentru a finaliza studiile pentru stabilirea importanţei factorului VEGF-A si a eficienţei transdiferenţierii in vivo pe 2 modele animale, şoarecii imunodeficieţi SCID-Beige (n=65) si C57Bl6/J (n=40). Pentru a analiza eficacitatea procesului de transdiferenţiere prin implantarea subcutanata (Sub-Q) a celulelor netransdiferentiate (NT) si transdiferenţiate (TD), co-implnatate cu celule care exprima VEGF-A au fost realizate 3 studii folosind cele 2 modele animale propuse. Astfel, atȃt şoarecii SCID-Beije cȃt şi C57BL6/J au fost utilizati pentru studiul de urmărire a celulelor implantate cu si fara administrarea unei diete grasa. Suplimentar, soarecii SCID-Beije au fost incluşi într-un studiu de inducere a diabetului cu streptozocina (STZ) după o perioadă de 30 şi respectiv 60 de zile de la implantarea subcutanată a celulelor, probele (ser, implant, ţesut hepatic şi pancreatic) fiind evaluate la 2-3 saptămȃni dupa inducerea diabetului. Validarea datelor obtinute din studiile in vitro si in vivo s-a realizat prin analiza celulelor inainte de implantare si dupa implantare la nivelul implantului, serului şi a ţesuturilor colectate (ficat, pancreas). Suplimentar, a fost realizată o analiza bioinformatica prin achiziția și prelucrarea seturilor de date transcriptomice publice si au putut fi puse în evidenţă noi gene asociate procesului EMT (CDH2, ITGB1, COL4A1, COL1A1, TNC, CCN2 și JUN), care au arătat o expresie mai mare la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 care asociază atat obezitate cȃt și carcinom hepatocelular (HCC). În plus, șase miARN (miR-21-5p, miR-26a-5p, miR-34a-5p, miR-106a-5p, miR-320a-3p și miR-424-5p) au fost găsite ca potențiale ţinte. Dintre acestea, am selectat miR-26a-5p și miR-424-5p, cele 2 miARN fiind considerate potențiali reglatori negativi ai procesului EMT-MET. Pe baza rezultatelor noastre, am găsit o semnătură genă/miARN care evaluează starea metabolică a ficatului (diabet/obezitate) și am identificat gene asociate miARN-EMT care ar putea prezice eficenţa tratamentul bolii hepatice diabetice.