» THERRES

THERRES

Publicatii Rezultate Etapa I Rezultate Etapa II Rezultate Etapa III Rezultate Etapa IV Rezultate Etapa V

OBIECTIVE

Cancerul gastric (CG) este o boala heterogena, cu aproape un milion de cazuri noi care apar in fiecare an la nivel mondial. Cercetari recente ofera posibilitatea fara precedent de a face progrese substantiale in terapia CG. Terapiile tintite au revolutionat tratamentul CG, dar beneficiile raman limitate la cateva luni de crestere a supravietuirii. Provocarea actuala este de a stratifica cat mai bine pacientii in vederea implementarii unei terapii adecvate, si de a identifica rezistenta primara si dobandita la medicamente. Pana in prezent au fost efectuate putine studii pentru a evalua biomarkerii de raspuns la terapia anti-HER2, anti-MET, anti-VEGFR2 in CG, precum si punctele de control ale sistemului imun care contribuie la dezvoltarea rezistentei tumorale. Mai mult, combinarea terapiei tintite cu inhibarea punctelor de control ale sistemului imun – domeniul actual cel mai interesant si activ in cercetare datorita raspunsurilor durabile observate in melanomul malign si cancerul pulmonar – se numara printre ariile noi de frontiera in cercetarea tarapiei antitumorale si ar putea reprezenta o dezvoltare majora in tratamentul CG.

Institutul Clinic Fundeni si cei doi parteneri (UMF Craiova și Institutul de Virusologie „Stefan S. Nicolau”), organizații publice de cercetare cu tradiție in domeniul biomedical, isi propun sa dezvolte colaborarea trans-disciplinara clinica, academica, economica si sa creeze prin sinergie o agenda comuna de CDI. Prin corelarea si coordonarea activitatilor si resurselor, proiectul se concentrează asupra valorificării infrastructurii de cercetare a partenerilor.

Rezultatele ar putea avea o importanță majoră în domeniul terapiei cancerului gastric, contribuind la îmbunătățirea calității vieții si supraviețuirii pacienților cu cancer gastric, prin traducerea rezultatelor științifice în noi oportunități de tratament personalizate.

Obiectiv general

THERRES este un proiect extrem de ambitios si inovator dedicat unui domeniu de actualitate: asocierea imunoterapiei cu medicamente orientate molecular in cancerul gastric, ca metoda moderna de tratament. Proiectul urmareste implementarea unui nou sistem de clasificare pentru a distinge subtipurile de cancer gastric si a caracteriza reglatorii activarii functiei imunitare (immune checkpoints).

Obiectivele specifice ale proiectului sunt:

Obiectivul 1: Identificarea de biomarkeri si tinte potentiale pentru terapie in subtipurile de CG definite pe baza clasificarilor genomice recente

Obiectivul 2: Identificarea de biomarkeri de raspuns si de rezistenta la terapia standard anti-HER2, anti-MET si anti-VEGF in CG

Obiectivul 3: Caracterizarea particularitatilor stromei vasculare in CG, inclusiv a rolului punctelor de control ale sistemului imun in subtipuri de CG.

Ca rezultat cheie, proiectul va genera instrumente de decizie pentru tratamentul si managementul pacientilor cu CG printr-o abordare personalizata. Rezultatele prezentului proiect vor contribui la imbunatatirea performantelor, calitatii si vizibilitatii internationale a rezultatelor stiintifice romanesti in domeniul oncologic.

Publicații Etapa 1-2 (Noiembrie 2018- Decembrie 2019)

Comunicări la congrese naționale/ internaționale

Sîrbu M, Șorop A, Chivu-Economescu M, Dima L, Chiosa A, Dima S, Popescu I. Molecular classification of gastric cancer opens new opportunities into personalized treatment, poster în cadrul ediției a XIVa a Simpozionului Academician Nicolae Cajal, 17-19 octombrie 2019, București, România.
Necula LG, Matei L, Dragu D, Neagu AI, Pitica I, Mambet C, Bleotu C, Dima S, Popescu I, Diaconu CC, Chivu-Economescu M. Diagnostic role of circulating COL10A1 in gastric cancer, prezentare în cadrul ediției a XIVa a Simpozionului Academician Nicolae Cajal, 17-19 octombrie 2019, București, România.
Necula LG, Matei L, Dragu D, Neagu AI, Pitica I, Nedeianu S, Mambet C, Bleotu C, Dima S, Popescu I, Diaconu CC, Chivu-Economescu M. Plasma level of COL10A1 is associated with tumor stage and survival in patients with Gastric Cancer, prezentare în cadrul “Advances in Cancer Research and Therapy”, 11-12 noiembrie 2019, Madrid, Spania.
Matei L, Dragu D, Necula LG, Neagu AI, Pitica I, Nedeianu S, Mambet C, Bleotu C, Dima S, Popescu I, Diaconu CC, Chivu-Economescu M. Classification of Gastric Cancer samples according to protein expression and MSI status based algorithm, prezentare în cadrul “Advances in Cancer Research and Therapy”, 11-12 noiembrie 2019, Madrid, Spania.
Chivu-Economescu M, Necula LG, Dragu D, Matei L, Neagu AI, Bleotu C, Sarbu M, Dima SO, Diaconu CC, Popescu I. New molecular classification of gastric cancer opens new avenues to novel therapeutic strategies, prezentare orală în cadrul “The 12th National Pathology Symposium, sesiunea Omics in pathology, 21-23 noiembrie 2019, București, România.
Cherciu I, Tatiana IE, Cazacu I, Saftoiu A. New insights into gastric cancer and precision medicine.17th World Congress of Gastroenterology. Poster.. 21-24 septembrie 2019 in Istanbul, Turcia.

Articole in extenso

Necula L, Matei L, Dragu D, Neagu AI, Mambet C, Nedeianu S, Bleotu C, Diaconu CC, Chivu-Economescu M. Recent advances in gastric cancer early diagnosis. World J Gastroenterol. 2019 May 7;25(17):2029-2044. doi: 10.3748/wjg.v25.i17.2029. PMID: 31114131; IF= 3.411.

Publicații Etapa 3 (Ianuarie 2020- Decembrie 2020)

Comunicări la congrese naționale/ internaționale

Harbiyeli IF, Cazacu IM, Ivan ET, Serbanescu MS, Hurezeanu B, Saftoiu A. Artificial intelligence in endoscopy for gastric cancer assessment: machine over man or perfect harmony? Congresul ESGE, 23–25 aprilie 2020, publicat in Endoscopy; 52(S 01): S23.
Herlea V. Aspecte morfologice și factori prognostici în carcinomul gastric., prezentare în cadrul Conferinței Webinar „Tratamente Inovative în Oncologie” – ediția a VII-a, 27 noiembrie 2020
Chivu-Economescu M. High PD-L1 expression in Epstein-Barr virus positive and microsatellite unstable cancers, prezentare în cadrul Conferinței Webinar „Tratamente Inovative în Oncologie” – ediția a VII-a, 27 noiembrie 2020
Chivu-Economescu M,Matei L, Necula L, Dragu D, Neagu AI, Sorop A, Bleotu C, Dima S, Irinel P. Evaluation of tumor immune microenvironment to predict and guide immunotherapeutic response, prezentare în cadrul Congresului Național de Citometrie a XIIIa Ediție, sesiunea de Imunologie, 16-18 decembrie 2020

Articole in extenso

Chivu-Economescu M, Necula LG, Matei L, Dragu DL, Neagu AI, Alexiu I, Bleotu C, Diaconu CC. Gastrointestinal cancer stem cells as targets for innovative immunotherapy. World J Gastroenterol. 2020 Apr 14;26(14):1580-1593. doi: 10.3748/wjg.v26.i14.1580. PMID: 32327907; IF= 3.665.
Necula L, Matei L, Dragu D, Pitica I, Neagu AI, Bleotu C, Dima S, Popescu I, Diaconu CC, Chivu-Economescu M. High plasma levels of COL10A1 are associated with advanced tumor stage in gastric cancer patients. World J Gastroenterol. 2020 Jun 14;26(22):3024-3033. doi: 10.3748/wjg.v26.i22.3024. PMID: 32587446; IF=3.665.

Etapa 4 (Ianuarie 2021- Decembrie 2021)

Comunicări la congrese naționale/ internaționale

Vlad Herlea. Rolul diagnosticului imunohistochimic in prognosticul adenocarcinomului gastric, prezentare în cadrul Stop Cancer, 23-25 Septembrie 2021, online.
Sacerdoțianu VM, Ungureanu BS, Iordache S, Constantinescu CE, Cazacu SM, Pirici D, Stroescu C, Șurlin V, Gheonea DI, Saftoiu A. Tumor Angiogenesis Assessment by Dynamic Contrast Harmonic Imaging Endoscopic Ultrasound (CHI-EUS) and Immunohistochemical Analysis in Gastric Cancer – a Feasibility study. Congresul ESGE Days. 25-27 martie 2021, publicat in Endoscopy;53(S 01): S226.
Sacerdoțianu VM, Ungureanu BS, Iordache S, Constantinescu CE, Cazacu SM, Pirici D, Stroescu C, Șurlin V, Gheonea DI, Saftoiu A. Tumor Angiogenesis Assessment by Dynamic Contrast Harmonic Imaging Endoscopic Ultrasound (CHI-EUS) and Immunohistochemical Analysis in Gastric Cancer – a Feasibility study. Digestive Disease Week. ePoster 21-23 mai 2021.
Croitoru VM, Filippi A, Cazacu IM, Kitahara S, Matsui A, Lauwers G, Sorop A, Necula LG, Matei L, Pechianu C, Croitoru AE, Herlea V, Saftoiu A, Chivu-Economescu M, Dima S, Duda DG, Popescu. Prognostic significance of immune checkpoint molecule expression in resectable gastric adenocarcinoma. Congresul Molecular Analysis for Precision Oncology Virtual Congress, 07-09 Octombrie 2021, publicat in Annals of Oncology (IF: 51.769), 32(6):S1357-S1357, Abstract: 37P.
Cazacu IM., Filippi A, Croitoru VM., Kitahara S, Matsui A, Lauwers G., Sorop A., Necula LG., Matei L., Pechianu C, Croitoru AE., Herlea V, Saftoiu A, Paul D, Chivu-Economescu M, Dima S, Duda DG, Popescu I. Validation of a new scoring system for molecular subtyping of gastric cancer. Congresul Molecular Analysis for Precision Oncology Virtual Congress, 07-09 Octombrie 2021; publicat in Annals of Oncology (IF: 51.769), 32(6):S1356-S1356, Abstract: 34P.

Articole in extenso

Chivu-Economescu M, Necula L, Matei L, Dragu D, Bleotu C, Diaconu CC. Clinical Applications of Liquid Biopsy in Gastric Cancer. Front Med (Lausanne). 2021;8:749250. doi: 10.3389/fmed.2021.749250. IF 3.9
Ungureanu BS, Sacerdotianu VM, Turcu-Stiolica A, Cazacu IM, Saftoiu A. Endoscopic Ultrasound vs. Computed Tomography for Gastric Cancer Staging: A Network Meta-Analysis. Diagnostics (Basel). 2021 Jan 16;11(1):134. doi: 10.3390/diagnostics11010134. IF 3.992
Ungureanu BS, Lungulescu CV, Pirici D, Turcu-Stiolica A, Gheonea DI, Sacerdotianu VM, Liliac IM, Moraru E, Bende F, Saftoiu A. Clinicopathologic Relevance of Claudin 18.2 Expression in Gastric Cancer: A Meta-Analysis. Front Oncol. 2021 Mar 4;11:643872. doi: 10.3389/fonc.2021.643872. IF 5.738
Liliac IM, Sacerdotianu MV, Ungureanu BS, Iordache S, Mogoanta L, Saftoiu A, Pirici D. Descriptive Analysis of Patients with Gastric Tumors Referred to the Largest Emergency Hospital in Oltenia Region-Romania, Between 2015-2020. Curr Health Sci J. 202;47(2):290-297. doi: 10.12865/CHSJ.47.02.21. Epub 2021 Jun 30. PMID: 34765251

Etapa 5 (Ianuarie 2022- Noiembrie 2022)

Comunicări la congrese naționale/ internaționale

Chivu-Economescu M, Necula L, Matei L, Dragu D, Neagu AI, Bleotu C, Sorop A, Herlea V, Dima S, Popescu I and Diaconu C. Soluble PD-L1 Level is Correlated with its Expression in Tissue and is Associated with Poor Overall Survival in Gastric Cancer. The 3rd Immuno-Oncology World Congress, 2-3 noiembrie 2022, Copenhaga, Denemarca.
Sacerdotianu VM, Ungureanu B, Iordache S, Rogoveanu I, Saftoiu A, Ciurea T. The role of Dynamic Contrast Harmonic Imaging Endoscopic Ultrasound (CHI-EUS) and CD105 and CD31 immunostaining in tumor angiogenesis assessment on patients with gastric cancer – a feasibility study, prezentare orală în cadrul The 18th World Federation for Medicine and Biology Congress in conjunction with the 2022 SRUMB Annual Conference and the EUROSON 2022, Timişoara, Romania. 27 mai 2022.
Ungureanu B, Victor, Sacerdotianu M, Iordache S, Rogoveanu I, Gheonea DI, Ciurea T, Saftoiu A.. The role of dynamic contrast harmonic imaging endoscopic ultrasound (CH-EUS) and cd105 and cd31 immunostaining in tumor angiogenesis assessment on patients with gastric cancer – a feasibility study, prezentare orală în cadrul Al 9-lea Congres EGEUS, iunie 2-3 2022, Cluj-Napoca, Romania.
Sorop A, Shuji Kitahara , Spiridon A, Mighiu I, Herlea V, Procop A, Almarii F,Setia N, Mullen J, Matsui A, Khachatryan A, Aoki S, Lauwers G, Dima S , Popescu I, Duda DG. Evaluarea biomarkerilor angiogenici și proinflamatori pentru diagnosticul și prognosticul eficient al cancerului gastric. Zilele Științifice ale Institutului Clinic Fundeni, 7-9 decembrie 2022.
Chivu-Economescu M, Necula L, Matei L, Dragu D, Neagu A , Bleotu C, Sorop S, Herlea V, Dima S, Popescu I, Diaconu C. PD-L1 solubil ca biomarker pentru progresia și prognosticul în cancerul gastric. Zilele Științifice ale Institutului Clinic Fundeni, 7-9 decembrie 2022.
Almarii F, Pechianu C, Procop A, Baltan A, Paslaru L, Fogarasi M, Sorop A, Stoica Mustafa E, Mihai M, Hortopan M, Iorgescu A, Dima S, Popescu I, Herlea V. Factori de prognostic morfopatologici corelați cu supraviețuirea in carcinomul gastric. Zilele Științifice ale Institutului Clinic Fundeni, 7-9 decembrie 2022.

Articole in extenso

Necula L, Matei L, Dragu D, Pitica I, Neagu A, Bleotu C, Diaconu CC, Chivu-Economescu M. Collagen Family as Promising Biomarkers and Therapeutic Targets in Cancer. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 12415. https://doi.org/10.3390/ijms232012415 IF=6.208/2021
Chivu-Economescu M, Necula LG, Matei L, Dragu D, Bleotu C, Sorop A, Herlea V, Dima S, Popescu I, Diaconu CC. Collagen Family and Other Matrix Remodeling Proteins Identified by Bioinformatics Analysis as Hub Genes Involved in Gastric Cancer Progression and Prognosis. International Journal of Molecular Sciences 2022; 23(6):3214. https://doi.org/10.3390/ijms23063214 IF=6.208/2021
Sacerdotianu VM, Ungureanu BS, Iordache S, Turcu-Stiolica A, Facciorusso A, Crinò SF, Saftoiu A. Diagnostic Value of Endoscopic Ultrasound after Neoadjuvant Chemotherapy for Gastric Cancer Restaging: A Meta-Analysis of Diagnostic Test. Diagnostics (Basel, Switzerland). 2022 Jan 3;12(1):100,. doi: 10.3390/diagnostics12010100. https://www.mdpcom/1433618 . IF= 3.706
Sacerdoțianu VM; Ungureanu BS; Iordache S; Cazacu SM; Pirici D; Liliac IM; Burtea DE; Șurlin V; Stroescu C; Gheonea DI; Săftoiu A. Gastric Cancer Angiogenesis Assessment by Dynamic Contrast Harmonic Imaging Endoscopic Ultrasound (CHI-EUS) and Immunohistochemical Analysis – a feasibility study. Journal of Personalized Medicine (ISSN 2075-4426) 2022 Jun 21; 12(7). DOI: 10.3390/jpm12071020. https://www.mdpi.com/2075-4426/12/7/1020/htm IF= 4.945
Liliac IM, Ungureanu BS, Mărgăritescu C, Sacerdoțianu VM, Săftoiu A, Mogoantă L, Moraru E, Pirici D. E-Cadherin Modulation and Inter-Cellular Trafficking in Tubular Gastric Adenocarcinoma: A High-Resolution Microscopy Pilot Study. Biomedicines. 2022 Feb 1;10(2):349. doi: 10.3390/biomedicines10020349.. https://www.mdpi.com/2227-9059/10/2/349 . IF= 757
Fogarasi M, Dima S. The Catalytic Domain Mediates Homomultimerization of MT1-MMP and the Prodomain Interferes with MT1-MMP Oligomeric Complex Assembly. Biomolecules. 2022;12(8):1145. doi: 10.3390/biom12081145. PMID: 36009039– IF 6.064
Fogarasi M, Dima S. Development of vectors for reformatting scFv fragments derived from phage display libraries into native IgG1 structures for in vivo imaging and therapeutic applications, 2022. Submitted
Sacerdotianu MV, Ungureanu BS, Iordache S, Filip M, Pirici D, Liliac IM, Saftoiu A. Accuracy of Endoscopic Ultrasonography for Gastric Cancer Staging. Current Health Sciences Journal. 2022 Jan-Mar; 48(1):88-94. doi: 10.12865/CHSJ.48.01.13. https://www.chsjournal.org/article/48/1/13/
Liliac IM, Sacerdotianu VM, Ungureanu BS, Mogoanta L, Margaritescu C, Pirici D, Saftoiu A, Crisan A. Subtle immunoreactivity differences in the fractal patterns of membrane E-Cadherin in gastric adenocarcinoma. Curr Health Sci J, 2022 Jul-Sept;48(3):in press.

Etapa 1 (Octombrie 2018- Decembrie 2018)

Pe parcursul primei activitati (10.10.2018-21.12.2018) ne-am concentrat asupra primului nostru obiectiv care vizeaza explorarea a noi tinte pentru imunoterapie in cinci noi subtipuri de cancer gastric (CG), definite pe baza unui sistem molecular contemporan de clasificare a bolii. Aceste cinci subtipuri sunt subtipul Gp1 alcatuit din probe Epstein-Barr (EBV) pozitive, subtipul Gp 2 – cu instabilitate ridicata a microsatelitelor (MSI), subtipul Gp 3 – caracterizat prin expresia aberanta a E-cadherinei, subtipul Gp 4 cu un numar mare de mutatii TP53 si subtipul Gp5 – probe TP53 negative.

Ca o prima etapa, am stabilit algoritmul pentru clasificarea esantioanelor de CG bazat pe teste de expresie a ARN si proteinelor: detectarea Epstein-Barr (EBV) prin testul de hibridizare in situ pentru EBER (Epstein-Barr virus (EBV)-encoded small RNAs), statusul de instabilitate a microsatelitelor (MSI) prin PCR urmat de secventire pentru analiza de fragmente, si imunohistochimie (IHC) pentru E-cadherin, p53 si MUC2, CDX2, CD10, MUC5AC, MUC6, HER2.

In faza actuala, am testat expresia EBV in sange (Activitatea 1.1) prin expresia EBNA (antigen nuclear EBV) si am constatat ca 85 dintre esantioanele noastre (69,7%) au fost pozitive si 37 (30,3%) au fost negative. In continuare, am aplicat testarea EBER, care este standardul de referinta pentru detectarea EBV in tesut, asociat cu tumora si am constatat ca doar 24,05% din esantioanele noastre sunt pozitive. Aceste probe au fost incluse in primul subtip (Gp1).

In acelasi timp, am inceput extragerea ADN-ului din probele de tesuturi congelate (Activitatea 1.2), incluse in lotul retrospectiv, pentru a efectua in urmatoarea activitate, in 2019, analiza statusului MSI care ne va ajuta la stratificarea probelor in subtipul 2 (Gp2). O alta activitate, initiata, a fost legata de analiza unui panou reprezentativ de biomarkeri tisulari prin IHC: E-caderina, p53, MUC2, CDX2, CD10, MUC5AC, MUC6 si HER2, care va ajuta la stabilirea celorlalte trei subtipuri de CG.

Intre timp, am inceput extractia ARN total (Activitatea 1.3), din lotul retrospectiv, care va fi utilizat in investigarea profilului transcriptomic in toate cele cinci subtipuri de cancer gastric pentru a indeplini primul nostru obiectiv: explorarea tintelor pentru imunoterapie pe fiecare dintre cinci subtipuri moleculare de CG.

Etapa 2 (Ianuarie 2019- Decembrie 2019)

Pe parcursul celei de-a doua faze a proiectului (01.01.2019-21.12.2019) am continuat activitatile incepute in anul precedent cu scopul de a gasi noi tinte imunoterapeutice, specifice fiecarui subtip de cancer gastric (CG). In acest scop, am finalizat investigatiile privind lotul retrospectiv cu analiza unui panou de biomarkeri prin imunohistochimie (IHC): E-cadherin, p53 si MUC2, CDX2, CD10, MUC5AC, MUC6, HER2 (Activitatea 2.1). Mai mult, am realizat o analiza a statusului MSI (instabilitatea microsatelitelor) (Activitatea 2.2) si am realizat o clasificare completa a probelor noastre incluse in lotul retrospectiv in cele cinci subtipuri de CG.

Clasificarea lotului retrospectiv a relevat un procent mai crescut al incidentei grupului EBV pozitiv in cadrul lotului nostru comparativ cu cel din cadrul lotului TCGA (The Cancer Genome Atlas): 24.05% vs. 6.82%. Referitor la grupul cu MSI, se observa o incidenta similara, aceasta fiind de 12.66% in lotul din Romania comparativ cu 16.59% in lotul TCGA. Pentru cel de-al treilea grup, cel cu stabilitate genomica si mutatii in cadrul geneiu CDH1 am observat o incidenta foarte apropiata 12.66% vs. 11.36%. Aproximativ 40.51% dintre pacientii lotului nostru retrospectiv apartin subtipului Gp4 cu instabilitate cromozomiala si amplificari ale genei TP53. La acestia se adauga circa 7.59% probe care nu contin amplificari in gena TP53, dar contin amplificari in gena pentru MUC6. Aceste probe au corespondenta in clasificarea TCGA in cadrul grupului CIN, cu instabilitate cromozomiala, care reprezinta aproximativ 50.68%.

Aceasta clasificare a fost foarte importanta in aplicarea selectiei probelor care au fost supuse analizei transcriptomice prin ARN-seq (Activitatea 2.3).

In paralel, am continuat activitatea noastra in ceea ce priveste colectarea si stocarea probelor noi pentru a crea o cohorta de pacienti cu CG care vor fi utilizati pentru validarea prognostica a biomarkerilor selectati in urma analizei ARN-seq (Activitatea 2.4).

Etapa 3 (Ianuarie 2020- Decembrie 2020)

În această etapă a fost făcută analiza bioinformatică a datelor de RNA-Seq pentru compararea exprimării genice în probele de țesut tumoral comparativ cu țesut netumoral din cohorta retrospectivă de pacienți (Activitatea 3.1) si au fost identificate genele modificate semnificativ și căile biologice în care sunt implicate acestea.

S-a continuat recrutarea pacienților în cohorta prospectivă de pacienți și bancarea probelor biologice de țesut normal și tumoral, plasmă, ser și buffy coat, în momentul de față fiind înrolați în această cohortă 67 de pacienți cu adenocarcinom gastric. Dintr-un set de 50 alicote de țesut tumoral a fost extras ADN total pentru determinarea statusului instabilității microsatelitare (MSI) iar un alt set de 40 de probe de țesut tumoral de la aceiași pacienți a fost utilizat pentru evaluarea imunohistochimică a exprimării proteice (E-caderină, p53, MUC2, CDX2, CD10, MUC5AC, MUC6 și HER2) și evaluarea prin prin hibridizare in situ a statusului EBER. Aceste date au fost utilizate pentru împărțirea cohortei de pacienți în 5 grupuri de prognostic (Activitatea 3.2).

Din probele de țesut tumoral proaspăt au fost inițiate 7 linii celulare și au fost achiziționate suplimentar alte două linii celulare de cancer gastric disponibile comercial (Activitatea 3.3) pentru utilizarea în studii funcționale.

Etapa 4 (Ianuarie 2021- Decembrie 2021)

In cadrul etapei 4 s-au realizat studii functionale care implica ligandul PD-L1 exprimat diferentiat la suprafata a patru linii celulare: Hs746T, AGS, NCI-N87 si KATOIII, precum si la suprafata a patru culturi primare initiate din fragmente tumorale recoltate de la pacienti cu cancer gastric (CG) din lotul prospectiv. Aceste culturi au fost selectate in urma unor studii extinse de citometrie in flux prin care s-a urmarit expresia mai multor molecule tip immunecheckpoints (ICP), raportate in etapelor anterioare, ca fiind exprimate pe suprafata celulelor tumorale gastrice. Rezultatele au condus la dezvoltarea unui model pentru analiza functionala a interactiei dintre tintele imune PD1/PD-L1, si s-a demonstrat ca in prezenta unei expresii crescute a PD-L1 pe suprafata celulelor tumorale, nivelul de apoptoza indus in prezenta unui inhibitor al interactiei PD1/PD-L1 este mai crescut.

S-a continuat recrutarea pacienților în lotul prospectiv și bancarea probelor biologice de țesut normal și tumoral, plasmă, ser și buffy coat. In cadrul etapei 4 au fost inclusi in studiu 29 de pacienti cu adenocarcinom (ADK) gastric, astfel pana in prezent s-a realizat o biobanca cu un lot prospectiv de 94 de pacienti in total. In etapa 4, din lotul prospectiv au fost clasificati un numar de 22 de pacienti cu ADK de stomac in 5 subtipuri moleculare pe baza nivelului de expresie a celor 14 markeri specifici fiind evaluati prin hibridizare in situ petru determinarea statusului EBER si prin imunohistochimie pentru determinarea nivelului de expresie proteica. Pentru cei 29 de pacienti s-a realizat extractie de acizi nucleici (ARN total si ADN genomic), aceste probe fiind ulterior utilizate in evaluarea nivelului de expresie a markerilor identificati prin RNASeq pentru fiecare grup prognostic. Mai mult s-a realizat dezvoltarea unui modelul de organoid in cancerul gastric din tesutul tumoral si non-tumoral de la 3 pacienti din lotul prospectiv pentru investigarea implicarii unor molecule in procesul de tumorigeneza. Partenerul P1, UMF Craiova, până în prezent a inclus în studiu 40 pacienți și au fost stocate in total 40 probe de sânge pentru teste genetice și moleculare. Prin intermediul endoscopiei au fost prelevate 240 probe de țesut normal și 240 probe de țesut tumoral. S-a realizat evaluarea vascularizatiei, fiind stabilita media dimensiuni vaselor si media densitatii vaselor pe baza marcarii imunohistochimice a markerului CD105. De asemenea, s-a evaluat angiogeneza in cancerul gastric folosind testele moleculare și examinări imunohistochimice.

In continuare s-a realizat evaluarea celulelor T citotoxice, utilizând colorarea imunohistochimică (IHC) a markerului CD8+ și acordarea unui scor de la 0 la 3 pentru 102 pacienți cu ADK de stomac din lotul retrospectiv. Rezultatele au aratat ca atunci când a fost comparat nivelul infiltratului cu celule T CD8+ măsurat prin metoda IHC cu cel obținut din analizele de RNA-seq, s-a observat un model foarte similar al diferențelor dintre grupe, cu un nivel relativ crescut al celulelor T CD8+ în Gp 1 (EBV+) și relativ scăzut în Gp 2 (MSI) și Gp5 (P53 normal).

Etapa 5 (Ianuarie 2022- Noiembrie 2022)

In cadrul etapei 5 s-au analizat modificarile principale induse la nivelul cailor de semnalizare in co-culturii celulare de cancer gastric cu expresie crescuta de PD-L1 cu limfocite T umane cu expresie de PD1, in prezenta unor inhibitori ai interactiei PD1/PD-L1 si VEGFR2. Rezultatele experimentele au indicat o reducere a transmiterii semnalului pe caile de semnalizare Ras/MAPK/ERK, Ras/MAPK/JNK, PI3K/AKT/mTOR/p70 S6 kinaza, STAT3 si STAT6, mai ales in cazul utilizarii inhibitorului interactiei PD1/PDL1 ceea ce atesta efectul benefic al imunoterapiei in cancerul gastric cu celule PDL1 pozitive. Tratamentul cu inhibitor al VEGFR2 a indicat o crestere al efectului inhibitor in special pe calea PI3K/AKT/mTOR/p70 S6 kinaza. Acest model functional poate fi utilizat in studii ulterioare pentru a valida si alte immune-checkpoints (LAG3, TIM3, IDO, BTLA) drept tinte pentru terapie la nivelul celulelor tumorale gastrice.

Totodata, s-a continuat recrutarea pacienților în lotul prospectiv și bancarea probelor biologice de țesut normal și tumoral, plasmă, ser și buffy coat. In cadrul etapei 5 au fost inclusi in studiu 24 de pacienti cu adenocarcinom (ADK) gastric, astfel pana in prezent s-a realizat o biobanca cu un lot prospectiv de 121 de pacienti in total. Pana in etapa 5, din intregul lot prospectiv au fost clasificati 62 de pacienti cu ADK de stomac in cele 5 subtipuri moleculare pe baza nivelului de expresie a celor 14 markeri specifici fiind evaluati prin hibridizare in situ petru determinarea statusului EBER si prin imunohistochimie pentru determinarea nivelului de expresie proteica. In plus, pe lotul prospectiv, s-a evaluat nivelul de expresie al genei PDL1 la 71 de pacienti cu ADK de stomac prin qRT-PCR, iar rezultatele au aratat ca nivelul de expresie al PD-L1 este semnificativ crescut in tumora comparativ cu tesutul adiacent non-tumoral.

Studiile post-translaționale ale traficului vezicular în cancer, prin colocalizarea E-caderinei și LAMP-1 la nivel tisular au evidențiat un profil dinamic al procesului de tranziție epitelial- mezenchimală, astfel punându-se în evidență progresia și metastazarea cancerului gastric.

Prin IHC au fost analizate urmatoarele tinte imune pe lotul prospectiv, ce cuprinde un numar de 62 de pacienti cu adenocarcinom de stomac: LAG-3, TIM-3, CTLA4, PD-L1, PD1, CD4 si CD8. Rezultatele arata ca prin analiza rolului prognostic a markerilor imuni checkpoints IHC, grupul de pacienți cu LAG-3 cu un status IHC negativ au o rată de supraviețuire semnificativ mai slabă decât grupul cu LAG-3 IHC pozitiv. Pe baza rezultatelor obtinute in cadrul studiului, LAG-3 ar putea reprezenta o alta tinta imuna importanta in cancerul gastric, rezultatele de IHC confirmand prezenta acestei proteine in proportie de 80% dintre probele analizate.

INFORMATII GENERALE

Titlu proiect: „Mecanisme si biomarkeri de raspuns si rezistenta la terapiile curente tintite ale cancerului gastric”

Cod proiect complex: PN-III-P4-ID-PCCF2016-0158

Nr contract: PCCF 17/2018

Acronim: THERRES

Autoritatea de finantare: Unitatea Executiva pentru Finantarea Invatamantului Superior, a Cercetarii Dezvoltarii si Inovarii (UEFISCDI)

Competitia: PN-III-P4-ID-PCCF 2016

Coordonator: Institutul Clinic Fundeni

Director de proiect: Prof Dr Irinel Popescu

Durata proiect: 19.10.2018 – 20.10.2022 (48 luni)

Valoarea totala a proiectului: 8.400.000 lei

Valorea Institutului Clinic Fundeni: 3.400.000 lei

PARTENERI

Institutii partenere in proiect:

P1 – Universitatea de Medicina si Farmacie din Craiova

Responsabil Partener: Prof. Dr. Adrian Saftoiu

P2 – Institutul de Virusologie „Stefan S. Nicolau”

Responsabil Partener:

CSI Dr. Mihaela Chivu Economescu