Rezultate
Etapa 1 (Mai 2018- Decembrie 2018)
În cadrul proiectului Proiect Complex 66PCCDI/2018 s-a urmărit în prima etapa punerea la punct a tuturor protocoalelor necesare pentru desfășurarea în condiții optime a activităților proiectului. Pentru îmbunătățirea resursei umane, in acest interval, au fost angajati 7 noi cercetatori: 3 asistenti de cercetare – ICF, 1 asistent de cercetare – IBPC, 1 doctorand – UB, 1 asistent de cercetare – UMF Iasi, 1 asistent de cercetare, doctorand – UMF Craiova. In conformitate cu structura planului de cercetare, in prima etapa s-a efectuat includerea pacientilor in studiu:
- CO a inclus prospectiv 38 de pacienti cu tumori pancreatice de la care s-a prelevat și biobancat in Centrul de Medicina Translationala, Institutul Clinic Fundeni (CEMT), probe de țesut tumoral, non-tumoral și sânge. In cadrul subproiectului 4 au fost incluse probe obtinute prin punctie aspirativa cu ac fin (FNA)la pacienti cu PDAC nerezecabil. In urma analizelor de secventiere pentru 8 probe de tesut tumoral si non-tumoral (confirmate PDAC) in cadrul secventierii intregului exom (WES) au fost generate aproximativ 200 Gb de date, iar in urma analizei de secventierea a intregului transcriptom (WTS) s-au obtinut aproximativ 50 Gb de date. În plus, pe baza studiului bazei de date de mutații somatice COSMIC, a fost constituit un panel de 40 de gene, cu semnificație pentru diagnostic, prognostic și terapia personalizată a cancerului pancreatic.
- În cadrul Clinicii I Chirurgie a Institutului Regional de Oncologie Iași (P1) au fost incluși un număr de 10 pacienți diagnosticati cu cancer de pancreas rezecabil cu viza curativă
- Partenerul UB (P3) a realizat analiza RT-PCR a expresiei TRPM8 în linii celulare de cancer de pancreas (MIA PaCa-2, Panc-1 și PK-9) precum și linia celulară pancreatică necanceroasă HPDE. De asemenea, in subproiectul 5 s-au optimizat metodele de transfectie a receptorilor TRP in celule care exprima proteina reglatoare.
- Partenerul IBPC (P4) a optimizat etapele de fixare, colorare si deshidratare a criosectiunilor din protocolul de microdisectie cu laser intrucat de aceste etape depind atat cantitatea si calitatea ARN/ADN obtinut din fragmentele microdisecate, cat si prezervarea morfologiei tisulare necesara pentru usurinta identificarii structurilor de interes.
Etapa 2 (Ianuarie 2019- Decembrie 2019)
În cadrul proiectului Proiect Complex 66PCCDI/2018 s-a urmărit în a doua etapa desfășurată în perioada ianuarie 2019- decembrie 2019, analiza intregului exom, analiza intregului transcriptom si analiza de secventiere tintita. Pentru îmbunătățirea resursei umane, in acest interval, au fost angajati 7 noi cercetatori: 2 asistenti de cercetare – ICF, 3 doctoranzi – UB, 1 asistent de cercetare, doctorand – UMF Craiova.
In acest studiu, CO a inclus (prospectiv in cadrul Pr 1, Pr 2 si Pr 3) 100 de pacienti cu tumori pancreatice. Diagnosticul de adenocarcinomul ductal de pancreas (PDAC) a fost confirmat pentru 27 din cei 100 de pacienti de la care s-au prelevat atat tesut tumoral, non-tumoral cat si sange. În cadrul Clinicii I Chirurgie a Institutului Regional de Oncologie Iași au fost incluși 9 pacienți diagnosticati cu cancer de pancreas rezecabil cu viza curativă. In cadrul Subproiectului P4 s-a definitivat si s-a implementat protocolul de extractie acizi nucleici din material tisular obtinut prin FNA si respectiv ccfDNA la pacientii cu adenocarcinoma pancreatic. S-a completat prospectiv baza de date clinice, care in prezent cuprinde 86 subiecti (55 inclusi de CO ICFundeni si 31 inclusi de Partenerul P3 UMF Craiova. In Centrul de Medicina Translationala, Institutul Clinic Fundeni (CEMT), probele au fost bancate si stocate in conditii optime, creand astfel o valoroasa banca de material biologic (tesut tumoral si non-tumoral, sange si plasma) prelevat de la pacienti cu PDAC.
In urma analizelor de secventiere pentru 20 probe de tesut tumoral microdisecat (confirmate PDAC) in cadrul secventierii a intregului exom (WES) au fost generate aproximativ 200 GB de date si s-au gasit peste 1200 de mutatii de tip indels pentru fiecarea proba analizata, iar in urma analizei de secventierea a intregului transcriptom (WTS) s-au obtinut aproximativ 250 GB de date si prin analiza bioinformatica au fost obtinute peste 600 de gene diferential exprimate intre tesutul tumoral vs non-tumoral. In Subproiectul 4 s-a constituit un panel de 1121 mutatii somatice cuprinzand hot spoturi din 40 gene cu semnificatie pentru adenocarcinomul pancreatic. Aceste gene au fost selectate in urma studierii bazei de date de mutatii somatice COSMIC, incluzand genele cu semnificatia cea mai mare pentru diagnostic, prognostic si terapia personalizata in adenocarcinomul pancreatic. S-a realizat protocolul de investigare prin secventiere tintita de noua generatie, utilizand platforma de secventiere Illumina Nextseq500 (CEMT ICFundeni) pentru un lot de 28 pacienti cu PDAC confirnat histopatologic. In urma secventierii au fost identificate 114 variante genetice in FNA si respectiv 104 variante, in ccfDNA, cu o concordanta de peste 90% intre cele doua tipuri de matrita ADN. Acesta este primul studiu de acest tip realizat in Romania. In subproiectul 5 s-au urmarit studiile funcționale și structurale ale receptorilor TRP exprimați în adenocarcinomul pancreatic (ADK). Astfel s-au obținut rezultate despre expresia proteinelor TRP în țesuturi ADK de la pacienți din banca de țesuturi a Institutului Clinic Fundeni. La UB au fost realizate experimente de analiză a stării de glicozilare a proteinei TRPM8 cu spectroscopie de Terahertz și prin modelare moleculară. Aceste rezultate au fost trimise spre publicare la jurnalul”Biophysical Biochimica ACTA General Subjects”. S-a studiat expresia și funcția proteinelor TRPA1 în linii celulare ADK, rezultate care au fost prezentate la Congresul Internațional de Biofizică de la Madrid între 20 și 24 iulie 2019. S-au realizat studii pilot și pe liniii celulare conditionate cu gemcitabină, pentru a vedea implicațiile rezistenței la gemcitabină în funcțiile receptorului TRPM8.
Etapa 3 (Ianuarie 2020- Decembrie 2020)
În cadrul proiectului Proiect Complex 66PCCDI/2018 s-a urmărit în a etapa 3 desfășurată în perioada ianuarie 2020- decembrie 2020, analiza intregului exom, a intregului transcriptom si analiza de secventiere tintita. In acest studiu, CO a inclus (prospectiv in cadrul Pr 1, Pr 2 si Pr 3) 101 pacienti cu PDAC de la care s-au prelevat atat tesut tumoral, non-tumoral cat si sange. Dintre acestia 19 au fost inclusi in cadrul etapei (CO si P1). Mai mult, in Centrul de Medicina Translationala, Institutul Clinic Fundeni (CEMT), probele au fost bancate si stocate in conditii optime, creand astfel o valoroasa banca de material biologic (tesut tumoral si non-tumoral, sange si plasma) prelevat de la pacienti cu PDAC. In cadrul suproiectului 4 au fost inclusi in studiu 10 pacienți cu tumori pancreatice nerezecabile (CO) si 31 pacienti de la P2 (22 cu diagnostic confirmat de PDAC). De asemenea, in subproiectul 4 s-a generat lotul de studiu pentru validarea prospectiva a datelor rezultate in urma investigarii profilului mutational prin secventiere NGS. In acest lot 68 noi pacienti diagnosticati cu cancer de pancreas nerezecabil la diagnostic. In urma analizelor de secventiere intregului exom (WES) pentru 20 probe de tesut tumoral microdisecat (confirmate PDAC) de catre P4 au fost generate aproximativ 200 GB de date si s-au gasit peste 1200 de mutatii de tip indels pentru fiecarea proba analizata, iar in urma analizei de secventiere a intregului transcriptom (WTS) au fost obtinute peste 600 de gene diferential exprimate intre tesutul tumoral vs non-tumoral. In cadrul activitatii 3.22, CO a realizat investigarea profilului mutational al pacientilor cu cancer pancreatic non-rezecabil la diagnostic rezultat in urma activitatii 2.4.2, utilizand tehnica tehnica „secventierii tintite” de noua generatie, utilizand un filtru de 1% pentru variantele genice, crescand astfel acuratetea analizei si sansa detectarii de mutatii somatice specific PDAC. In cadrul activitatii A3.23 Co si P1 au cercetat mai multe metode de validare a datelor de secventiere precum: secventiere utilizand probe TAQMAN, secventiere Sanger, CAST-PCR, pirosecventiere, digital droplet PCR etc. Una dintre metodele cele mai utile pentru utilizarea clinica si care a fost investigate in cadrul Pr4 este genotiparea utilizand probe TAQMAN, avand in vedere costul redus si posibilitatea de a investiga profilul mutational pentru cazuri individuale. Cercetarile au indicat o buna concordanta a rezultatelor furnizate de genotiparea TAQMAN utilizand gDNA extras din FNA si respective cfDNA. In cadrul activitatii A.3.24 CO si P2 au utilizat tehnicile de scevntiere TAQMAN, DD-PCR si SNV Nanostring pentru validarea rezultatelor obtinute in cadrul activitatile anterioare. Profilul mutational a fost sintetizat in grupe cu semnificatie pentru medicina personalizata, propunandu-se un protocol de investigare genetica a pacientilor cu cancer pancreatic avansat locoregional, non-rezecabil la diagnostic, cu aplicabilitate clinica din perspectiva medicinei personalizate. In urma validarii clinice, protocolul ar putea regrupa aproximativ 40% din totalul pacientilor cu ADK non rezecabil la diagnostic, cu recomandare de terapii personalizate disponibile in practica curenta la ora actuala (A3.25). In subproiectul 5 (Pr5) s-a analizat funcția TRP în procesul de tumorigeneză. Astfel am obținut rezultate despre expresia proteinelor TRPA1 în culturi celulare și participarea lor în ciclul celular și in procesele de migrație celulară. Partenerul P3 a fost realizat experimente de analiză a expresiei și funcției proteinelor TRPA1 în linii celulare ADK, rezultate care au fost trimise la publicare și se află în proces de evaluare la revista Scientific Reports. Am realizat studii pilot și pe liniii celulare conditionate cu gemcitabină, pentru a vedea implicațiile rezistenței la gemcitabină în funcțiile receptorului TRPM8. Rezultatele privind starea de glicozilare a proteinei TRPM8 cu spectroscopie de Terahertz și prin modelare moleculară au fost publicate în jurnalul”Biophysical Biochimica ACTA General Subjects”. Am menținut un număr de patru tineri doctoranzi în echipa de cercetare. CO a realizat experimente de determinare a expresiei genice a familiei TRP prin RT-PCR pe un lot de 95 de pacienti ( perechi de tesut tumoral si normal).
Etapa 4 (Ianuarie 2021- Septembrie 2021)
În cadrul proiectului Proiect Complex 66PCCDI/2018 s-a urmărit în ultima etapa desfășurată în perioada ianuarie 2021- septembrie 2021, analiza si interpretarea datelor genomice si validarea profilurilor mutationale la pacientii PDAC. In cadrul acestei etape au fost evaluati (prospectiv in cadrul Pr 1, Pr 2 si Pr 3) 55 de pacienti cu tumori pancreatice. In cadrul studiului au fost inclusi 18 pacienti confimati cu diagnosticul de adenocarcinom ductal de pancreas (PDAC) de la care s-au prelevat atat tesut tumoral, non-tumoral cat si sange. În cadrul Clinicii I Chirurgie a Institutului Regional de Oncologie Iași au fost incluși, in perioada ianuarie 2021- septembrie 2021, un pacient diagnosticat cu cancer de pancreas (PDAC) rezecabil cu viza curativă. Mai mult, in Centrul de Medicina Translationala, Institutul Clinic Fundeni (CEMT), probele au fost bancate si stocate in conditii optime, creand astfel o valoroasa banca de material biologic (tesut tumoral si non-tumoral, sange si plasma) prelevat de la pacienti cu PDAC. In cadrul suproiectului 4 au fost inclusi in studiu 22 pacienți cu tumori pancreatice non-rezecabile. In urma analizelor de secventiere pentru 30 de probe de tesut tumoral si non-tumoral (confirmate PDAC) in cadrul secventierii a intregului exom (WES) au fost generate aproximativ 225 GB de date (FASTQ +BAM. Rezultatele arata ca, conform scorului PolyPhen a fost obtinut un profilul mutational pentru lotul de probe tumorale derivate din tesutul microdisecat impartit astfel: 76% sunt considerate mutatii benigne (fara implicatii cunoscute in tumorigeneza), 14 % mutatii cu un potential risc in procesele de tumorigeneza si 10% mutatii cu un risc crescut in procesele de tumorigeneza la pacienti cu PDAC, fiind similare cu cele obtinute in probele tumorale bulk. Genele cu cea mai buna concordanta si cu frecventa mutationala > 90% in ambele grupe de probe, sunt: TP53, SYNE1, ERBB2, CFTR. In subproiectul 4 s-a constituit un panel customizat cuprinzand 40 gene cu semnificatie pentru adenocarcinomul pancreatic. Aceste gene au fost selectate in urma studierii bazei de date de mutatii somatice COSMIC, incluzand gene cu semnificatia cea mai mare pentru diagnostic, prognostic si terapie personalizata. In subproiectul 5 s-a urmarit stabilirea conditiilor de cultura a linii celulare pentru studiul PDAC, de asemenea s-au optimizat medotele de transfectie a receptorilor TRP in celule care exprima proteina reglatoare. Rezultatele obținute din acest studiu sugerează că TRPM8 exprimat în celule adenocarcinomului pancreatic ductala